Consejos de HILIC, parte 5 Ajustar correctamente las sales para la fase HILIC móvil

La adición de sal a la fase móvil HILIC mejora la reproducibilidad y la forma de los picos, optimizando así la calidad de la separación. Pero, ¿qué sales son las más adecuadas? ¿Cómo se pueden disolver de forma fiable en fases móviles con un alto contenido en acetonitrilo? ¿Y qué influencia tienen las sales en la separación?

Normalmente, se añaden sales a la fase móvil para poder controlar las interacciones electrostáticas entre los analitos cargados y la fase estacionaria. Esto mejora la forma de los picos de los analitos que se eluyen, al reducir el ensanchamiento de los picos. Hay que tener en cuenta algunos aspectos al respecto.

Sales adecuadas para el método HILIC

Normalmente, en la HILIC se utilizan sales como el acetato de amonio y el formiato de amonio, y en ocasiones también el bicarbonato de amonio (véase la fig. 2). Curiosamente, estas sales también se disuelven en mezclas de disolventes con un alto contenido en acetonitrilo, como suele ser habitual en la HILIC al inicio de los análisis. Al mismo tiempo, debido a su volatilidad, estas sales son compatibles con la posterior detección por espectrometría de masas, que constituye una técnica de detección muy utilizada en HILIC. Siempre que sea posible, se debe evitar el uso de sales menos solubles, como los fosfatos, o de reactivos de pares iónicos, como el TFA, si se tiene previsto realizar una detección por MS. Sin embargo, si se utilizan detectores espectroscópicos, sí es posible emplear sales «no volátiles». Estas sustancias presentan de forma más acusada los denominados «efectos de sal» y pueden tener efectos cosmotrópicos y caotrópicos sobre las moléculas cargadas, es decir, reforzar o perturbar los enlaces de puente de hidrógeno [1]. Sin embargo, esto iría demasiado lejos en este contexto y puede consultarse en los escritos de Andrew J. Alpert.

Por lo tanto, la mayoría de las fases móviles HILIC se preparan añadiendo acetato de amonio o formiato de amonio. Estas dos sales no se pueden utilizar de la misma manera, ya que el formiato de amonio da lugar a un pH más ácido en la fase móvil que el acetato de amonio.

Una mezcla de ambas sales permite ajustar de forma precisa el valor del pH de la fase móvil dentro de un rango determinado.

Influencia de la salinidad

El efecto fundamental de la concentración de sal en la fase móvil puede describirse de la siguiente manera: Las sales influyen en las interacciones electrostáticas de las moléculas cargadas con los materiales de columna cargados o zwitteriónicos (véase Consejo HILIC n.º 3). En caso de atracción electrostática entre los analitos y la fase estacionaria, se aplica lo siguiente: el aumento de la concentración de sal provoca una menor retención.

Por consiguiente, en el caso de la repulsión electrostática entre los analitos y la fase estacionaria, ocurre lo contrario: el aumento de la concentración de sal provoca una mayor retención del analito correspondiente.

El segundo efecto del uso de sales o del aumento de la concentración salina en la fase móvil se manifiesta en el espesor de la capa de agua sobre la superficie de los materiales HILIC polares. El elevado contenido de disolvente orgánico en la fase móvil al inicio de una separación hace que la sal se acumule preferentemente en la capa de agua. Por lo tanto, una concentración creciente de sal da lugar a un aumento del espesor de la capa de agua, lo que, en principio, va acompañado de una mayor retención de todos los analitos polares (excepto en los casos mencionados anteriormente). Por lo tanto, un contenido significativo de sal provoca una mayor retención incluso en el caso de analitos polares no cargados, aunque estos no puedan formar interacciones electrostáticas. En la figura 2 se muestra un esquema explicativo al respecto. Los trabajos en los que se basa este estudio los llevamos a cabo hace ya unos 15 años en la fase ZIC-HILIC y los publicamos en un artículo [2].

Preparación de la fase móvil

Para garantizar una reproducibilidad suficiente de la retención y la forma del pico, es necesario que la fase móvil tenga una concentración final de sal de al menos 5 mmol/L y que dicha concentración se mantenga estable de forma permanente. Ya hemos analizado en otra ocasión los efectos de un gradiente salino y no los tendremos en cuenta aquí [3]. Sin embargo, la solubilidad de las sales en la fase móvil con un alto contenido en disolvente orgánico puede resultar problemática y a menudo provoca la precipitación de las sales en la solución.

En el caso de las fases móviles con un contenido de acetonitrilo del 95 %, la concentración de sal debería mantenerse inicialmente por debajo de 15 mmol/L, debido a su solubilidad limitada.

En la figura 3 se muestra un procedimiento convencional para la preparación de fases móviles para la HILIC. A modo de ejemplo, se preparará 1 L de una fase móvil de acetonitrilo/agua (95:5, v/v) con una concentración final de acetato de amonio de 10 mmol/L. Es fundamental que el acetato de amonio se disuelva primero por completo en agua pura. Para ello, se preparan primero 50 mL de una solución acuosa de acetato de amonio con una concentración de 200 mmol/L. Con una simple agitación, la sal se disuelve completamente en el agua en pocos segundos. A continuación, mientras se agita continuamente, se añaden lentamente 950 mL de acetonitrilo a los 50 mL de la solución acuosa de acetato de amonio. De este modo, se obtiene 1 L de una fase móvil con una relación acetonitrilo/agua de 95:5 (v/v) y una concentración final de acetato de amonio de 10 mmol/L.

La solución final puede presentar ahora pequeñas partículas turbias en el fondo de la botella. Esto indica una disolución imperfecta de la sal en la fase móvil. El uso de botellas de cristal transparentes puede ayudar a controlar este efecto. Agitar enérgicamente, incluso durante toda la noche, no mejorará la solubilidad de la sal. Sin embargo, para disolver completamente la sal, se debe someter la botella con la solución a un baño de ultrasonidos hasta que la solución se vuelva transparente y las gotitas o partículas hayan desaparecido. Normalmente, una exposición al ultrasonido de 30 minutos es más que suficiente.

Una vez que la sal se haya disuelto por completo, la fase móvil puede filtrarse como de costumbre y queda entonces directamente disponible para su uso cromatográfico. Este procedimiento también puede aplicarse a otras fases móviles HILIC y modificarse según sea necesario. El contenido de agua, el tipo de sal y la concentración de sal pueden adaptarse específicamente a cada aplicación. Además, es importante que el tratamiento con ultrasonidos sea reproducible. En particular, la intensidad y la duración de la sonificación deben mantenerse siempre constantes.

Efecto de la salinidad

Además de influir en las interacciones electrostáticas, la concentración de sal afecta al espesor de la capa de agua, lo que también afecta a la retención de compuestos no cargados. Un alto porcentaje de disolvente orgánico en el eluyente hace que la sal se vea empujada preferentemente hacia la capa acuosa. Por lo tanto, un aumento de la concentración de sal da lugar a una capa acuosa más gruesa. Este doble efecto de la concentración de sal se observa en algunas separaciones. Ejemplo:

Separación del ácido 2-hidroxibenzoico y del ácido 4-hidroxibenzoico (2-HB y 4-HB; identificados en la figura 4 como n.º 1 y n.º 2) en tres columnas con propiedades diferentes (tal y como se muestra en la figura 4 y se ha extraído del original [3]). A un pH neutro, ambos analitos se encuentran en su estado con carga negativa debido a la desprotonación del grupo carboxílico. Un aumento de la concentración de acetato de amonio de 10 mM a 15 mM, con un porcentaje constante del 90 % de acetonitrilo en la fase móvil, provoca en el caso del 4-HB un aumento significativo de su unión a la columna de diol neutro y un tiempo de retención mayor.

A título informativo: el 2-HB presenta un enlace de puente de hidrógeno intramolecular entre el grupo carboxilo y el grupo hidroxilo [5], por lo que esta molécula se comporta cromatográficamente de forma muy «apolar» (como, por ejemplo, el tolueno) y, por lo tanto, no se retiene en una columna HILIC neutra.

Volviendo a la separación polar: la retención claramente mayor con una mayor concentración salina, debida a la mayor espesor de la capa de agua, se observa con claridad en el 4-HB, sobre todo en las fases neutras.

La influencia de la concentración de sal en la retención se atribuye además a un efecto de salación [1]. En este proceso, las moléculas de agua se unen en mayor medida a la solvatación de los iones de sal, lo que reduce la solvatación de los analitos y puede favorecer sus interacciones directas con la fase estacionaria. En el caso de la fase amino con carga positiva, se observa una atracción electrostática con ambas moléculas, es decir, con los aniones 2-HB y 4-HB (en el caso de este último, mucho más pronunciada debido a su hidrofilia). Un aumento de la concentración de sal provoca una disminución de la atracción electrostática, con la consiguiente disminución de la retención.

Como ya se ha comentado, en las fases estacionarias zwitteriónicas, el grupo catiónico interno provoca una atracción electrostática de los analitos con carga negativa, como el 2-HB y el 4-HB. Al mismo tiempo, estos analitos sufren un rechazo electrostático por parte del grupo aniónico externo de la fase estacionaria. Sin embargo, estas fuerzas no son determinantes, ya que el efecto principal en este caso no es la interacción electrostática, sino, sobre todo, el aumento del espesor de la capa de agua cuando aumenta la concentración de sal.

En el próximo consejo de HILIC nos centraremos en los efectos combinados de los productos orgánicos y la sal.

Bibliografía

[1] A.J. Alpert: «Efecto de las sales sobre la retención en la cromatografía de interacción hidrofílica». Journal of Chromatography A 2018, 1538, 45-53

[2] G. Greco, S. Grosse y T. Letzel: «Estudio del comportamiento de retención en cromatografía de interacción hidrofílica zwitteriónica de ácidos hidroxi- y aminobenzoicos isoméricos». Journal of Chromatography A 2012, 1235, 60-67.

[3] T. Letzel: «Especificaciones de los gradientes en la cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC)». En: «HPLC de gradiente para profesionales: RP, LC-MS, análisis iónico, biochromatografía, SFC, HILIC». Stavros Kromidas (ed.) Wiley-VCH; ISBN-10: 352734408X; 1.ª edición (17 de abril de 2019), págs. 175-182

[4] G. Greco y T. Letzel: «Principales interacciones e influencias de los parámetros cromatográficos en las separaciones HILIC». Journal of Chromatographic Science, 2013, 51 (7), 684-693.

[5] S. Grosse y T. Letzel: «Cromatografía líquida / espectrometría de masas con ionización a presión atmosférica y mezcla de líquidos poscolumna para la determinación eficaz de hidrocarburos aromáticos policíclicos parcialmente oxidados». Journal of Chromatography A 2007, 1139, 75-83.

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Los autores

Dr. Thomas Letzel: Fundador y director general del Instituto de Investigación Analítica para el Cribado No Dirigido GmbH (AFIN-TS), www.afin-ts.de

Thomas Letzel se formó como técnico de laboratorio químico, posteriormente estudió Química y se doctoró en análisis medioambiental. Posteriormente, realizó estancias de investigación analítica en Ámsterdam y en Múnich (en la TUM, donde desde 2009 también imparte clases como profesor privado de «Química Analítica y Bioanalítica»). Desde 2018, investiga y asesora (como parte del trío fundador) desde su propio instituto de investigación y se ha propuesto integrar en mayor medida el método HILIC como técnica de HPLC en la práctica analítica diaria.

Dr. Stefan Bieber: Fundador y director general del Instituto de Investigación Analítica para el Cribado de Compuestos No Objetivo, S.L. (AFIN-TS)

Junto con Thomas Letzel, Stefan Bieber dirige AFIN-TS GmbH en calidad de director general y lleva muchos años dedicado al cribado de moléculas no dirigidas.


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Dra. Annette Dibowski:Directora general de Dichrom GmbH, www.dichrom.com

Annette Dibowski no solo es directora general de Dichrom y asesora comercial en Biotech Fluidics, sino también una apasionada «investigadora polar» en el campo de la cromatografía de compuestos polares.