Observar cómo las células inmunitarias atacan a las células cancerosas 1.024 trampas, 14 horas y una punta de pipeta

¿Con qué eficacia elimina una célula inmunitaria una célula cancerosa y cuánto tiempo tarda en hacerlo? Las pruebas habituales solo proporcionan valores medios. El chip CellTrap de la TUM captura células inmunitarias y cancerosas en 1.024 microtrampas y realiza un seguimiento de cada encuentro durante un máximo de 14 horas, sin necesidad de bombas ni equipos especiales.

Las inmunoterapias, como la terapia con células CAR-T o con células CAR-NK, se basan en un proceso fundamental: una célula inmunitaria reconoce una célula tumoral, se une a ella y la destruye. El hecho de que esto ocurra, y la rapidez con la que sucede, varía considerablemente de una célula a otra. Sin embargo, las pruebas de citotoxicidad habituales trabajan con muchos miles de células a la vez. En los ensayos de liberación, las células inmunitarias y las cancerosas se cultivan juntas en placas de pocillos, y se mide lo que las células moribundas liberan al medio. La citometría de flujo analiza las células individualmente, pero solo como una instantánea de un cultivo masivo en un momento determinado. Ambos métodos muestran cuántas células diana han muerto, pero no qué célula inmunitaria fue la responsable, cuándo se produjo el contacto o si una célula cancerosa se enfrentó a uno o varios atacantes.

Los valores medios ocultan los momentos decisivos

Esto tiene consecuencias prácticas. Las células inmunitarias poco frecuentes, pero especialmente activas, se pierden en promedio, al igual que las células tumorales resistentes. Además, los ensayos en placas de micropozos requieren un gran número de células, lo que supone un problema cuando las células primarias son escasas o se trata de células inmunitarias modificadas genéticamente.

Los sistemas microfluídicos entran en juego aquí: encapsulan unas pocas células en espacios definidos y las observan a lo largo del tiempo. Sin embargo, los enfoques establecidos tienen sus propias desventajas. Los sistemas de gotitas encapsulan las células en emulsiones de aceite; esto evita la interferencia, pero el medio no se puede sustituir. No se reponen los nutrientes en el minúsculo volumen de las gotitas, lo que limita la microscopía de células vivas durante largos periodos de tiempo, y quedan descartados los pasos de tinción posteriores. Las plataformas que emparejan células de forma selectiva, por ejemplo, mediante fuerzas eléctricas, acústicas u ópticas, alcanzan altas tasas de emparejamiento, pero requieren bombas, equipos especiales y experiencia. Las matrices de micropozos abiertas son más sencillas, pero los micropozos comparten un medio común, por lo que las moléculas liberadas pueden propagarse entre ellos.

El chip: 1.024 trampas y una punta de pipeta

CellTrap (véase la fig. 1), desarrollado en el Centro de Investigación Traslacional del Cáncer (TranslaTUM) de la TUM, sigue un enfoque deliberadamente sencillo. El chip está fabricado con el polímero de silicona transparente PDMS y está fijado a un portaobjetos estándar (25 mm × 75 mm). Un canal principal se ramifica simétricamente a lo largo de ocho niveles. Al final de esta red hay 1.024 trampas, cada una de 30 µm de ancho, dispuestas en una fila de unos 6 cm de longitud. Esto simplifica la captura de imágenes: el chip se escanea a lo largo de una línea con un objetivo de 10x, y se combinan varias docenas de imágenes individuales de alta resolución para formar una imagen global de todas las trampas. Cada trampa termina en dos o tres canales de filtrado, que miden solo 2 µm de ancho y 4 µm de alto. El medio de cultivo fluye a través de ellos, mientras que las células quedan retenidas (véase la fig. 2).

No se necesita ninguna bomba. La suspensión celular se introduce en una punta de pipeta de 1 ml, que se coloca en la entrada. Una columna de líquido de unos 10 cm de altura genera una presión de aproximadamente 1 kPa e impulsa unos 4 µl por minuto a través del chip. Una gota de 20 µL con unas 2.000 células llega a las trampas en pocos minutos. Además, el flujo se regula por sí mismo: en cuanto una trampa se ocupa, su resistencia al flujo aumenta y el líquido se desvía hacia las trampas vacías. Por lo tanto, las células capturadas se encuentran en un entorno prácticamente en reposo con una tensión de cizallamiento muy baja. A continuación, la punta de la pipeta se sustituye por pequeños depósitos cerrados, y el chip se coloca en un microscopio de fluorescencia con cámara de incubación, como los que se encuentran en muchos laboratorios de biología celular.

El azar como principio de diseño

En lugar de buscar emparejamientos perfectos uno a uno, CellTrap aprovecha el azar. Las células inmunitarias y las cancerosas se mezclan y se cargan juntas; el número de células de cada tipo que acaba en una trampa sigue la distribución de Poisson (véase el recuadro informativo). En un experimento con células de glioblastoma (U87) y células NK, 142 de las 1.024 trampas (aproximadamente el 14 %) contenían exactamente una célula inmunitaria y una célula cancerosa, 42 trampas (el 4 %) contenían dos células inmunitarias y una célula tumoral, y 36 trampas (el 3,5 %) presentaban la proporción inversa; 537 trampas (algo más de la mitad) contenían solo un tipo de célula y sirvieron como controles (véase la fig. 3). De este modo, un único paso de carga proporciona varias relaciones efector-objetivo (E:T) y controles adecuados en el mismo chip en condiciones idénticas. Esto reduce las variaciones entre pocillos o experimentos separados. Las mediciones con partículas fluorescentes y con células coincidieron estrechamente con la predicción estadística, lo que permite ajustar la distribución en función de la concentración celular.

Lo que el chip hace visible

Para demostrar que la plataforma es capaz de procesar muestras clínicamente relevantes, el equipo cultivó en primer lugar células inmunitarias estimuladas con IL-2 procedentes de sangre humana (células mononucleares de sangre periférica, PBMC) junto con células de glioblastoma que expresan una proteína fluorescente verde. En un plazo de 14 horas, la señal verde se atenuó en las trampas con células inmunitarias, mientras que las células cancerosas sin células inmunitarias permanecieron intactas. Para la caracterización sistemática, el equipo utilizó posteriormente la línea celular estandarizada de células NK NK-92 contra tres líneas celulares tumorales: glioblastoma (U87), leucemia mieloide crónica (K562) y adenocarcinoma colorrectal (LS174T). El cambio a la línea celular fue una elección deliberada: las células inmunitarias de diferentes donantes de sangre difieren considerablemente entre sí, y una línea celular uniforme permite separar las diferencias biológicas de los efectos técnicos del chip.

Hay dos parámetros que se complementan. En los primeros minutos, el chip registra señales de calcio en las células NK, uno de los primeros indicios de que una célula inmunitaria ha reconocido un objetivo. El patrón de la señal dependía del tipo de tumor: las células K562, que carecen de moléculas del MHC de clase I, provocaban picos bruscos y repentinos, mientras que las células U87 mostraban un aumento y una disminución más lentos. Las células inmunitarias sin una célula diana no mostraban este tipo de señal. Incluso en la misma trampa, una célula NK podía reaccionar intensamente, mientras que su vecina permanecía inactiva, una diferencia que las mediciones en poblaciones celulares no pueden distinguir.

A lo largo de 14 horas, el chip indica si la célula cancerosa muere. Las células tumorales están marcadas con un colorante azul estable, y el medio contiene el marcador de células muertas yoduro de propidio; solo las células que presentan ambas señales se consideran células tumorales muertas. Se excluyeron los casos en los que las células se dividieron o escaparon, para que cada proporción quedara claramente definida. En el caso de la línea celular U87, murieron aproximadamente el 22 % de las células cancerosas en una proporción de 1:1, alrededor del 13 % en una proporción de 1:2 y aproximadamente el 27 % en una proporción de 2:1. En los controles correspondientes, la muerte celular se situó en solo alrededor del 1 % (solo células inmunitarias) o del 4 % (solo células cancerosas), y la viabilidad de las células sin pareja superó el 93 % (fig. 4). Un mayor número de células inmunitarias por célula cancerosa aumentaba, por regla general, la muerte celular, aunque no con la misma intensidad en todas las líneas celulares.

Ventajas para el laboratorio

Para los usuarios, las ventajas residen sobre todo en la práctica. CellTrap no necesita bombas ni dispositivos de acoplamiento, sino solo una pipeta y un microscopio de fluorescencia con control de temperatura. El sistema funciona con un número reducido de células. Y como las trampas permanecen accesibles al flujo, los reactivos se pueden intercambiar directamente en el chip: tras ocho horas de cocultivo, el equipo ha fijado las células, las ha permeabilizado y las ha teñido con la enzima citotóxica granzima B, sin perderlas de las trampas. Los sistemas de gotitas no permiten este tipo de protocolos en varias etapas. El análisis también es escalable. Toda la serie de trampas se captura como una imagen microscópica compuesta, que un software desarrollado específicamente desglosa en 1.024 imágenes individuales. Para cada trampa se pueden determinar el recuento celular y la evolución de la fluorescencia a lo largo del tiempo. De este modo, un único chip proporciona varios cientos de encuentros celulares documentados, cada uno con su propia historia.

Aplicaciones y limitaciones

CellTrap es una herramienta de investigación, no una prueba diagnóstica. Sus puntos fuertes se ponen de manifiesto en todos aquellos ámbitos en los que son importantes las secuencias temporales y las diferencias entre células individuales: al comparar productos de células inmunitarias, como las células NK o T modificadas genéticamente; al analizar cómo los principios activos o los anticuerpos influyen en la destrucción celular; o al investigar por qué algunas células tumorales escapan al ataque. El concepto no se limita a las células inmunitarias y cancerosas; en principio, se puede introducir cualquier combinación de tipos celulares. El siguiente paso son los ensayos con células de pacientes, que en el futuro podrían ayudar a seleccionar inmunoterapias personalizadas. El diseño también tiene sus limitaciones: cada trampa aísla un pequeño grupo de células, por lo que no se reproduce la red de señales de un tumor real, y las células muy móviles o en división reducen el número de trampas evaluables.

Originalpublikation: Khan MZU, Kafshgari MH, Dezfouli AB, Hayden O, Multhoff G, Destgeer G. CellTrap: an instrument-free microfluidic platform for cell–cell interactions at stochastically generated effector-to-target ratios. RSC Advances 16 (2026). DOI: 10.1039/D6RA02345B