Cromatografía líquida miniaturizada Por fin a escala micro: cómo la impresión 3D reduce el tamaño de la HPLC

HPLC, pero en formato mini. Es más sostenible y económico gracias a su bajo consumo de disolvente, pero, aun así, apenas se utiliza. Los obstáculos tecnológicos son demasiado grandes. Sin embargo, las fases estacionarias fabricadas mediante impresión 3D podrían allanar el camino hacia sistemas «lab-on-chip» totalmente impresos y, con ello, dar un nuevo impulso a la micro y nano-LC.

La miniaturización es, desde hace años, una de las principales tendencias de desarrollo en el campo de la analítica instrumental. Los sistemas más pequeños requieren menos disolvente y menos muestra, permiten tiempos de análisis más cortos y abren nuevas aplicaciones, desde la analítica de procesos hasta los sistemas portátiles «lab-on-chip». Si bien la microfluídica se ha consolidado en muchos ámbitos, el desarrollo de columnas de separación cromatográfica miniaturizadas de alto rendimiento sigue representando un reto tecnológico hasta la fecha.

El proyecto de investigación 3DmiChrom de la Investigación Industrial Conjunta (IGF) ha adoptado, por ello, un nuevo enfoque: En lugar de columnas de relleno convencional, los científicos construyen fases estacionarias directamente en tres dimensiones mediante polimerización de dos fotones (2PP). Este proceso de fabricación aditiva, que actualmente ofrece la mayor resolución, permite obtener estructuras en el rango de los micrómetros y submicrómetros, lo que abre nuevos horizontes en la fabricación de monolitos cromatográficos.

Miniaturización de las columnas: ¿cuáles son los obstáculos?

Las ventajas de la cromatografía líquida miniaturizada se conocen desde hace tiempo [1-3]. Un menor consumo de disolventes reduce los costes operativos y el impacto medioambiental. Al mismo tiempo, los tiempos de análisis son más cortos, lo que permite que las aplicaciones de alto rendimiento, en particular, resulten más rentables. No obstante, hasta ahora los sistemas de CL microfluídicos solo han tenido una aceptación limitada, tanto en el ámbito académico como en el industrial.

Una de las razones principales de la lenta difusión de la micro y nano-HPLC es la extrema dificultad para llenar de forma reproducible el hardware de columnas necesario. Solo unos pocos fabricantes de columnas cuentan en su catálogo de productos con fases de separación con un diámetro interior < 1 mm.

Fases estacionarias de la impresora 3D

El proyecto de investigación conjunto entre la Universidad de Reutlingen y el Instituto de Medio Ambiente y Energía, Tecnología y Análisis (IUTA) (IUTA) se centró, por tanto, en el desarrollo de monolitos poliméricos fabricados mediante impresión 3D a partir del 2PP: En este proceso, una resina líquida se endurece exclusivamente en aquellos puntos en los que las moléculas absorben dos fotones simultáneamente [4-5].

Al inicio del proyecto, los socios identificaron las resinas fotosensibles adecuadas y, posteriormente, las perfeccionaron específicamente para aplicaciones cromatográficas. Dado que los materiales disponibles en el mercado no cumplían los requisitos de funcionalidad química y resistencia, se desarrollaron formulaciones propias de resinas para fases estacionarias hidrofílicas, hidrofóbicas e iónicas. Las formulaciones a base de metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA) y metacrilato de laurilo (LMA) resultaron especialmente exitosas, ya que mostraron tanto una elevada estabilidad química como una buena funcionalización.

Estructura porosa controlada digitalmente

Sin embargo, el verdadero avance radica en el diseño estructural de los monolitos. Mientras que los monolitos convencionales obtienen su estructura porosa principalmente mediante procesos de polimerización [6], en el caso del 2PP esta se define de forma totalmente digital.

Gracias a los modelos paramétricos de diseño asistido por ordenador (modelos CAD), se pudieron estudiar diferentes geometrías (véase la fig. 2). Además de las estructuras octaédricas, tetraédricas y esféricas, la geometría giroide resultó ser especialmente adecuada. Esta estructura TPMS (superficie mínima triplamente periódica) combina una elevada estabilidad mecánica con un sistema de poros macroscópicos excelentemente interconectado y unas propiedades de flujo favorables. Las simulaciones de mecánica de fluidos proporcionaron información adicional para futuras mejoras de la estructura tridimensional.

Macroporos reproducibles de hasta 1 µm

Uno de los resultados clave del proyecto fue la fabricación reproducible de sistemas de macroporos abiertos con diámetros de poro de hasta 1 µm. Para ello, no solo fue decisivo el proceso de impresión, sino, sobre todo, un tratamiento posterior optimizado de las fases estacionarias fabricadas. Y es que, tras la impresión, es necesario eliminar por completo el exceso de fotorresina de las complejas redes de poros. Para ello, los investigadores desarrollaron un proceso de limpieza reproducible, que se verificó mediante imágenes de nano-TC y mediciones de caudal. En la figura 3 se muestra el flujo de trabajo para la fabricación y el tratamiento posterior de las fases estacionarias impresas.

La porosidad jerárquica mejora la separación

Además de los macroporos definidos, se generó una estructura superficial mesoporosa. Esta porosidad jerárquica combina dos requisitos de las columnas de separación cromatográfica: Los macroporos de gran tamaño garantizan una baja resistencia al flujo, mientras que los mesoporos aumentan considerablemente la superficie específica y, con ello, mejoran la interacción entre el analito y la fase estacionaria. En el proyecto, los investigadores fabricaron estos sistemas de poros de forma selectiva y reproducible.

A continuación, se analizaron cromatográficamente los monolitos fabricados mediante impresión 3D. Tras la funcionalización hidrofóbica con metacrilato de laurilo, se logró por primera vez la demostración experimental de una funcionalidad de fase inversa. En condiciones de gradiente, se separó con éxito una mezcla de tres compuestos (véase la fig. 4).

Perspectiva: Sistemas LC fabricados íntegramente mediante fabricación aditiva

A largo plazo, la visión va mucho más allá de las columnas de separación individuales. Los participantes en el proyecto ya han desarrollado un primer chip de cromatografía líquida (LC) fabricado íntegramente mediante fabricación aditiva, en el que los microcanales y la fase estacionaria se crean en un único proceso de fabricación. Aunque aún es necesario seguir desarrollando la conexión con los sistemas periféricos de HPLC, el concepto pone de manifiesto el potencial que tiene la fabricación aditiva de cara al futuro para los sistemas analíticos integrados (véase la fig. 5).

Conclusiones y perspectivas

Los resultados del proyecto 3DmiChrom muestran que la microimpresión 3D basada en la polimerización de dos fotones en fase estacionaria es mucho más que un simple proceso de fabricación alternativo. Esta tecnología permite, por primera vez, el diseño digital específico de la geometría de los poros, la química de la superficie y el comportamiento de los flujos en monolitos cromatográficos. Con macroporos reproducibles de hasta 1 µm, monolitos poliméricos jerárquicamente porosos y las primeras separaciones cromatográficas exitosas, se ha alcanzado un hito fundamental en lo que respecta a los sistemas micro-LC fabricados íntegramente mediante fabricación aditiva.

En octubre de 2026 dará comienzo un proyecto de seguimiento del IGF. Se invita especialmente a las pequeñas y medianas empresas (pymes) de los sectores de la fabricación de fases estacionarias y de la fabricación aditiva a participar en la primera reunión del comité de seguimiento del proyecto. La reunión tendrá lugar el 1 de diciembre de 2026 en el Instituto de Medio Ambiente y Energía, Tecnología y Análisis e. V., en Duisburgo. En ella se presentarán los resultados del proyecto concluido y se ofrecerá una visión general de los trabajos de investigación previstos y las líneas prioritarias del proyecto sucesor. La reunión ofrece, además, la oportunidad de plantear sus propias necesidades y preguntas, así como de participar activamente en el desarrollo futuro del proyecto.

Agradecimientos

El proyecto IGF n.º 01IF22786N de la F.O.M. recibió financiación del Ministerio Federal de Economía y Energía (BMWE) en el marco del Programa de Fomento de la Investigación Industrial Conjunta (IGF), en virtud de una resolución del Bundestag alemán.

Bibliografía

• [1] Hetzel T, Loeker D, Teutenberg T, Schmidt TC. Caracterización de la eficiencia de las columnas de cromatografía líquida de microdiámetro mediante el análisis de Van Deemter y el gráfico cinético. J Sep Sci. 2016;39(20):3889-3897. doi: 10.1002/jssc.201600775.
• [2] Werres T, Schmidt TC, Teutenberg T. Influencia del diámetro interior de la columna en la eficiencia cromatográfica en la cromatografía líquida de ultra alto rendimiento miniaturizada y convencional. Chromatographia. 2023;86:143-151. doi: 10.1007/s10337-023-04237-4.
• [3] Vasconcelos Soares Maciel E, de Toffoli AL, Sobieski E, Domingues Nazário CE, Lanças FM. Cromatografía líquida miniaturizada centrada en columnas analíticas y espectrometría de masas: una revisión. Anal Chim Acta. 2020;1103:11-31. doi: 10.1016/j.aca.2019.12.064.
• [4] Hermatschweiler, M. La impresión 3D conquista la microescala: la litografía láser como motor de innovación para tecnologías clave. Laser Tech J. 2013;10(4):55-57. doi: 10.1002/latj.201300001 
• [5] Lachmayer, R.; Lippert, R. B. La fabricación aditiva cuantificada. Berlín: Springer; 2017. doi: 10.1007/978-3-662-54113-5.
• [6] Svec, F. Monolitos poliméricos porosos: una variedad asombrosamente amplia de técnicas que permiten su preparación. J Chromatogr A. 2010;1217(6):902-924. doi: 10.1016/j.chroma.2009.09.073.
• [7] Drieschner T, Werres T, Klassen M, Lang B, Lorenz A, Brecht M, Lorenz G, Teutenberg T, Kandelbauer A. Monolitos de polímero funcionalizado con estructura jerárquica mediante polimerización de dos fotones para columnas de separación HPLC miniaturizadas. Anal Chem. 2026. doi: 10.1021/acs.analchem.6c02512

Información sobre los autores

• Dr. Thorsten Teutenberg 
  Jefe del departamento de «Análisis de investigación y miniaturización», Instituto de Medio Ambiente y Energía, Tecnología y Análisis (IUTA)
• Tobias Drieschner 
  estudiante de doctorado, Universidad de Reutlingen
• Dr. Tobias Werres 
  investigador, Instituto de Medio Ambiente y Energía, Tecnología y Análisis (IUTA)
• Martin Klaßen 
  Jefe del departamento de «Higiene medioambiental y productos farmacéuticos», Instituto de Medio Ambiente y Energía, Tecnología y Análisis (IUTA)
• Björn Lang 
  ayudante estudiantil, Instituto de Medio Ambiente y Energía, Tecnología y Análisis (IUTA)
• Dra. Anita Lorenz 
  Química alimentaria, Universidad de Reutlingen
• Prof. Dr. habil. Marc Brecht 
  Vicepresidente de Docencia, Universidad de Reutlingen
• Prof. Dr. Günter Lorenz (†) 
  Catedrático de Química, Universidad de Reutlingen
• Prof. Dr. en Ingeniería, habilitado, ingeniero diplomado Andreas Kandelbauer 
  Vicedecano de Investigación de la Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Reutlingen