Microfluídica automatizada Una forma más sencilla de obtener imágenes de alta resolución de numerosas estructuras celulares

La microscopía de superresolución permite visualizar la disposición de las moléculas con precisión nanométrica. Sin embargo, los experimentos multiplex complejos siguen requiriendo muchas horas de trabajo manual. La microfluídica automatizada simplifica estos procesos, aumenta la reproducibilidad y allana el camino hacia la microscopía inteligente.

Durante décadas, uno de los objetivos más importantes de la microscopía ha sido alcanzar una resolución espacial cada vez mayor. La microscopía de superresolución (SRM) moderna ha desplazado este límite hasta unos diez nanómetros. Esto permite visualizar estructuras a escala nanométrica y la organización de las proteínas, que no pueden resolverse con la microscopía óptica convencional.

De una mayor resolución a más información biológica

Sin embargo, los sistemas biológicos son complejos. Una célula contiene numerosos orgánulos y estructuras que interactúan entre sí. Su organización espacial está estrechamente relacionada con la función celular. Por eso, hoy en día los investigadores no solo quieren obtener imágenes lo más nítidas posible de estructuras individuales, sino también estudiar el mayor número posible de componentes de una célula o un tejido en su relación espacial entre sí.

La microscopía de superresolución multiplexada se ha convertido, por tanto, en una herramienta importante para la obtención de imágenes biológicas modernas. Sin embargo, esto plantea al mismo tiempo un reto práctico: cuanto más información se quiera obtener de una muestra, más complejos se vuelven los procedimientos experimentales y más difícil resulta llevarlos a cabo manualmente.

DNA-PAINT permite la multiplexación molecular

En la microscopía de fluorescencia multicolor convencional, las distintas estructuras se marcan con fluoróforos de diferentes colores. Sin embargo, en la práctica solo es posible distinguir de forma fiable un número limitado de estructuras objetivo entre sí. 

DNA-PAINT adopta un enfoque diferente: secuencias cortas de ADN codifican la identidad de diferentes moléculas diana. A continuación, sondas de ADN complementarias y marcadas con fluorescencia generan las señales necesarias para la obtención de imágenes de alta resolución. Lo fundamental es que se pueden visualizar sucesivamente diferentes estructuras diana con el mismo colorante fluorescente. De este modo, se pueden sortear muchas de las limitaciones de la microscopía multicolor convencional.

En el denominado método Exchange-PAINT, las sondas de ADN fluorescentes se introducen sucesivamente en la muestra y se retiran de nuevo. De este modo, se pueden visualizar sucesivamente numerosas estructuras dentro de una misma muestra biológica. Así pues, el método ofrece una gran flexibilidad para experimentos multiplex; sin embargo, su aplicación práctica se vuelve cada vez más laboriosa a medida que aumenta el número de estructuras diana que se van a estudiar.

El trabajo manual se convierte en un cuello de botella

Cada ciclo de captura de Exchange-PAINT incluye la adición de las sondas de ADN, la captura de la imagen y varios pasos de lavado. Por lo tanto, un experimento multiplex requiere numerosos cambios de solución y suele durar varias horas.

Si estos pasos se realizan manualmente, requieren una atención constante. Las variaciones en el pipeteo, el lavado o los tiempos de incubación pueden afectar a la reproducibilidad y, en última instancia, también a la calidad de la imagen. Al mismo tiempo, la realización manual limita el rendimiento en cuanto al número de muestras.

Aquí se pone de manifiesto un reto fundamental de la microscopía moderna: mientras que las tecnologías de obtención de imágenes son cada vez más potentes, muchos procesos experimentales siguen basándose en la manipulación manual de las muestras. Por lo tanto, su automatización puede ser tan importante como el propio desarrollo del microscopio.

La microfluídica automatiza el flujo de trabajo de obtención de imágenes

Para eliminar este cuello de botella, hemos desarrollado una plataforma microfluídica automatizada para la microscopía de superresolución multiplexada.

En lugar de cambiar manualmente las soluciones de imagen, los distintos reactivos se suministran a través de canales de fluídica independientes y se introducen en la cámara de muestras mediante un sistema controlado por software. Un control suave mediante aire comprimido permite un cambio rápido y reproducible de la solución, al tiempo que se minimiza el impacto sobre la muestra y se reduce el consumo de reactivos.

En lugar de cambiar manualmente las soluciones de imagen, los distintos reactivos se suministran a través de canales fluídicos independientes y se introducen en la cámara de muestras mediante un sistema controlado por software. Un control suave mediante aire comprimido permite un cambio rápido y reproducible de la solución, al tiempo que se minimiza el impacto sobre la muestra y se reduce el consumo de reactivos.

El sistema se ha diseñado expresamente como un sistema complementario modular y puede combinarse con plataformas de microscopía ya existentes. Para experimentos más complejos, se pueden añadir fácilmente canales de fluídica adicionales si es necesario.

Esto supone claras ventajas para el día a día del laboratorio: mayor reproducibilidad, menos trabajo manual, menor consumo de reactivos y un mayor rendimiento en el procesamiento de muestras. Sobre todo, permite estandarizar los protocolos complejos de obtención de imágenes sin que sea necesario realizar cada paso de forma manual.

Un reto especial: las células del músculo cardíaco, que son muy sensibles

Las ventajas de un suministro controlado de líquido se hacen especialmente evidentes en el caso de las muestras biológicas sensibles.

Los cardiomiocitos primarios son células grandes del músculo cardíaco que, en algunos casos, se adhieren solo débilmente a la superficie de la cámara de muestras. Los lavados manuales repetidos pueden someter a las células a estrés mecánico o incluso desprenderlas de la superficie. Sin embargo, para la obtención de imágenes multiplexadas es necesario que la misma célula se mantenga estable a lo largo de varios ciclos de captura consecutivos.

La plataforma de microfluídica genera un flujo de líquido controlado con precisión y suave. Esto permitió sustituir repetidamente las soluciones de DNA-PAINT sin dañar los cardiomiocitos durante el experimento.

Con este enfoque se pudieron visualizar cinco estructuras diana diferentes dentro de un mismo cardiomiocito. Las imágenes de superresolución resultantes muestran la disposición detallada a escala nanométrica de las proteínas asociadas a la membrana dentro de la misma célula. Al mismo tiempo, los resultados ponen de manifiesto que la microfluídica automatizada permite obtener imágenes multiplex complejas incluso con muestras biológicas sensibles.

De la fluídica automatizada a la microscopía automatizada

Las posibilidades de la automatización microfluídica van mucho más allá del intercambio de sondas de ADN.

Dado que el sistema funciona mediante software, el cambio de solución se puede integrar directamente en la captura de imágenes. El microscopio podría capturar primero la primera estructura marcada con fluorescencia y, a continuación, llevar a cabo automáticamente los procesos de lavado y el cambio de la sonda de ADN antes de continuar con la captura de imágenes.

De este modo, no solo se puede automatizar un único paso del proceso, sino, a largo plazo, todo el flujo de trabajo experimental. Los experimentos complejos, que hoy en día requieren una supervisión continua por parte de usuarios experimentados, podrían llevarse a cabo siguiendo protocolos estandarizados con una intervención manual mínima. De este modo, la microscopía de superresolución multiplexada podría resultar más accesible también para personas no especializadas, centros de imagenología y estudios a gran escala.

El siguiente paso consiste no solo en automatizar esos flujos de trabajo, sino también en diseñarlos de forma adaptativa. La información de las imágenes obtenida durante el experimento podría ser analizada por el software y utilizada para determinar el siguiente paso experimental, como, por ejemplo, el ajuste de los parámetros de captura, la selección de una nueva región de la imagen o la sustitución selectiva de una solución.

Hacia la microscopía inteligente

Una plataforma muy prometedora para este tipo de flujos de trabajo es el microscopio de lámina de luz Flamingo.

Flamingo se ha concebido como una plataforma de imagen portátil cuya óptica, hardware y software pueden adaptarse a diferentes requisitos experimentales. Su arquitectura modular ofrece, por tanto, una base adecuada para combinar la fluídica automatizada con la captura de imágenes y los protocolos de microscopía adaptativos.

La visión a largo plazo es un microscopio inteligente en el que la obtención de imágenes, la manipulación de muestras y el análisis de datos ya no se realicen como pasos separados. En su lugar, la información obtenida durante la captura podría controlar el experimento en tiempo real, por ejemplo, seleccionando áreas relevantes de la imagen, ajustando los parámetros de captura o activando un cambio de solución.

La microfluídica desempeña un papel importante en este sentido: no solo permite al microscopio observar una muestra, sino también interactuar con ella de forma selectiva y controlar con precisión su entorno.

La automatización más allá de la microscopía

Estos mismos principios también pueden aplicarse fuera del ámbito de la microscopía de fluorescencia multiplexada. Los experimentos en nanotecnología del ADN y autoorganización molecular suelen requerir la adición y la eliminación de componentes moleculares con precisión temporal. La microfluídica automatizada puede encargarse de este control y, al mismo tiempo, reducir el consumo de reactivos y aumentar la reproducibilidad.

Conceptos similares también podrían resultar interesantes para nuevos enfoques experimentales en la intersección entre la nanotecnología y las ciencias cuánticas, en los que los entornos químicos controlados con precisión y los procesos experimentales automatizados desempeñan un papel importante.

La microfluídica automatizada es, por lo tanto, mucho más que una solución para el pipeteo repetitivo. Al combinar la manipulación controlada de muestras con la microscopía controlada por software, se convierte en un componente fundamental de una nueva generación de plataformas experimentales automatizadas y adaptativas.

Originalpublikation: Basak, S.; Chi-Vu, K.; Mougios, N.; Oleksiievets, N.; Pollack, Y.G.; Brandenburg, S.; Opazo, F.; Lehnart, S.E.; Enderlein, J.*; Tsukanov, R.*, “A versatile microfluidics platform for enhanced multi-target super-resolution microscopy”. ACS Nano, 20 (2026)